孟庆利

（北京养猪育种中心，北京    100085）

1960年，英格兰南部及东部地区死亡10万只火鸡，组织学检查发现肝实质细胞退行性变及胆管上皮细胞广泛增生。当时病因不明，称为“火鸡X病”，经研究发现是黄曲霉产生的一种荧光物质造成火鸡的死亡，  并将其命名为黄曲霉毒素(Aflatoxin)。黄曲霉毒素(AF)是一类毒性和致癌性很强的化合物，  1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物^[1]。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一^{[2]~ [4]} 。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。产生的黄曲霉毒素主要有Bi、B2、Gi、G2以及另外两种代谢产物Mi、M2。黄曲霉毒素的毒性有所差异，其中B1最强，然后依次是：MI>G1>B 2>M 2>B 2。

1  各国对黄曲霉毒素的要求

欧盟则规定从1998年起进口花生原料中的黄曲霉毒素限量由20ug/kg，花生制品由10ug/kg统一降至4ug/kg。美国政府的标准是人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量（指B1+B2+G1+G2的总量）不能超过15ug/kg。人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5ug/kg，其他动物饲料中的含量不能300ug/kg。我国政府规定玉米、花生、花生油等食品中黄曲霉B₁20ug/kg;饲料原料（花生饼、玉米）中黄曲霉毒素B1的允许量不超过50mg／kg。幼畜饲料产品中黄曲霉毒素的含量不能超过10ug/kg，成年家畜及肉牛、鹌鹑等不能超过20ug/kg。在日本，成年牛中当饲料中AFB₁超过20ug/kg，而对犊牛超过lOug/kg时，饲料则禁止用来饲喂。黄曲霉毒素主要是用薄层层析法、液相层析法、免疫方法、超微量分析法等进行测定。

2  黄曲霉毒素的毒害作用

黄曲霉度对畜禽的生产性能有显著的影响。产蛋鸡采食1mg／kg的AFB后体重下降（李家携等，1991^[5])，采食2mg/kgAF则饲料利用率降低(pobal等，1983)。家禽摄入AF后，肝增大、苍白、变脆、脂肪肝、胆管上皮增生等(Huff等，1986; Tuckam等，1994)。Sahoo(1996)等在兔的黄曲霉毒素免疫抑制试验中，观察到免的血清总蛋白水平下降了，此外，兔对绵羊红细胞的血凝集素结合水平也下降。鸡饲料中含AF可导致鸡体的免疫抑制反应。包括：淋巴细胞减少、T淋巴细胞减少(Hhosh等，1991)、细胞免疫受抑制和免疫球蛋白生成减少(Giambroneet等， 1978)。

3  黄曲霉毒素的薄层层析法的研究进展

薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1 990年，它被列为AOAC (Association of OfficialAgricultural Chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。薄层层析最早采用纸上层析和氧化铝薄层层析法进行黄曲霉毒素的分离分析，以目测定量，灵敏度为O.1mg/kg。1965年研究方法做了改进，改用硅藻土G或硅胶作为吸附剂进行薄层层析，同样以目进行测量，其灵敏度为5ug/kg。杨焱^[6]等(1996)研究认为薄层扫描法可使普通的薄层层析法全定量，AFB₁的定量线性范围在0，4-10ng，最小检测量为0.4ng，测定的精密度为CV 8.35%，方法回收率为98%。1980年卫生研究所胡文娟、韩玉莲（AFM₁在波长365nm紫外光照射下呈兰紫色荧光）建立了检测几种主要动物性食品中AFM1的薄层层析法，最低检出量为0.1～0.5Hg/kg(GB/T 5009.24-1996)。王宏亮^[7]等(1998)对国标GB5009.22-85薄层层析法测定饲料中黄曲雷毒素B1方法的改进，结果测得其回收率为76.9%，最低检出限量为5×l0^-9g改进后的方法，黄曲霉毒素B₁形成的斑点易现察，操作简便。

4  高效液相色谱检测黄曲霉毒素的研究进展

液相色谱(Liquid Chromatography，LC)与薄层层析在许多方面具有相似性，通常用TLC进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后，再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定。1984年报道了采用高效液相色谱法，最低检测限为0.3ug/kg。涂文升等(2002)用高效液相色谱法同时检测食品中四种黄曲霉毒素，结果发现2．Opg为最低检出限。宋欢^[8](2001)研究用液相色谱法测定饲科中的黄曲霉毒素B₁，结果发现此方法的平均回收率为86%，变异系数为2.24%。

5  酶联免疫方法检测黄曲霉毒素的研究进展

利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法，也是最常用，最基本的黄曲霉毒素检测方法。酶免测定方法的原理是将已知抗原吸附在固态载体表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合，再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。1977年，美国Lawellin等首次报道了反向直接竞争ELISA法（即将辣根过氧化物酶标记AFB₁），检测玉米中AFB₁。国内李秀芳等(1987)的建立反向直接竞争ELISA法）测定黄曲霉毒素B₁，刘滨磊等又先后建立了直接竞争ELISA、间接竞争ELISA和生物素-亲合素ELISA;这四种方法的最低检出限分别为0.05ng/ml、0.05ng/ml、0.02ng/ml和0.002ng/ml;它们的回收率~-别为 52.47-82.9%. 67.5-81.2%. 77.1-91.8%.85.9～93.2%。孙宗棠于1983年建立了AFB₁单克隆抗体放射免疫测定方法。李永镛、殷芬和俞顺章等人1992合作建立了AFB₁单克隆抗体的酶联免疫检测方法。1996年，Nakane建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术。符金华(1998)用酶联免疫测试法检测饲料中黄曲霉毒素B₁，最低检出限时2.5pg。路戈^[9]等(1996)用抗AFB₁的单克隆抗体AFB₁-2H8，建立了检测AFB₁的酶联免疫竞争抑制测定法(Competitive inhibition enzyme immunoassay-CIELA)。用该种方法检测饲料中的AFB₁，最低检出限为O.01ug/kg。1981年以来，Pestka等相继建立了过氧化物酶标记AFM₁的直接竞争酶联免疫吸附(ELISA)法。聂晶^[10]等(1993)建立了黄曲霉毒素AFM₁的间接竞争ELISA法，定此方法非特异件吸附低于2%，最低检出限量为10pg/ml，检测上限是5.Ong／血，检测最佳范围为0.2～2，Ong/ml。

6  饲料中黄曲霉毒素的HACCP控制

HACCP(Hazard analysis and critical controlpoints)即危害分析与关键控制点管理体系是一种以料安全为基础的预防性控制体系。它适用于控制影响饲料安全的生物性、化学性和物理性危害，其最大的优点是将以产品最终检验来保证产品质量转变为在生产过程中鉴别并控制潜在的危害，确保了饲料产品的安全性。HACCP的概念可以分为两个部分，一是危害分析即分析饲料生产、加工和贮藏各个步骤之危害因素及危害程度；二是主要管制点即依据危害分析结果设定主要管制点及控制方法。

6.1  危害分析

在对我国一些省市的饲料中黄曲霉毒素调查现，在检测时2万多份饲料样品中，北方各省饲料黄曲霉污染较轻，而长江沿岸和南方各省饲料黄曲霉污染较高，其检测阳性率比北方各省大数倍，甚至数十倍。

6.2  关键点控制

6.2.1   原料验收  水份含量控制在谷粒13%、玉米12. 5%、花生仁8%以下；玉米籽粒完整，无虫蛀、无霉变。饼粕类原料无结块。

6.2.2   原料贮存环境温度、湿度和氧气是造成饲料霉变的三个主要因素。在温度12～41℃条件下都能生长并产生黄曲霉毒素，温度25～320C，湿度80%一90%黄曲霉毒素最易生长。在原料贮存中，一定要注意空气、湿度、温度等的控制，要严格按照“先进先出”的使用原则，要及时清理已被污染的原料。

6.2.3   加工过程    黄曲霉菌更容易在已加工粉碎的谷物上生长，饲料加工生产过程中要避免料仓、成品仓中的结拱。制粒过程中要控制好蒸汽质量，制粒后冷却要充分，防止包装后水气凝结。

6.2，4  运输过程  装车时要保证车箱里没有水、不潮湿，运输时最好盖上防雨用具如帆布，一者可以防雨水，二者可以防阳光曝晒。

饲料行业的国际组织大多己采用HACCP管理体系，联合国动物饲料法典规定饲料生产应当推行HACCP管理体系，并将其纳入国际贸易中饲料的质量安全管理之中。我国饲料产品的卫生管理目前实行的是事后监督管理，迫切需要饲料生产企业加强产前和生产过程管理，消除各种安全隐患。在饲料黄曲霉毒素的毒性危害控制中引入HACCP这种预防性管理体系，使饲料生产对最终产品的检验（即检验是否有不合格产品）转化为控制生产环节中潜在的危害，将大大降低事后监督的成本，从而保证饲料产品和动物性食品的安全性。HACCP是决定产品安全性的基础，饲料生产者利用HACCP控制产品的安全性比利用传统的最终产品检验法要可靠，实施时也可作为谨慎防御的一部分。HACCP作为控制食源性疾患最为有效的措施得到了国际和国内的认可，并被FDA和世界卫生组织食品法典委员会批准。