猪瘟（slassical swine fever ，CFS）以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，是一种对猪危害性极大的传染病，被国际兽疫局（Office of International des E’pizooties，OIE）列为A类动物传染病。在世界许多国家和地区，传统 疫苗接种是控制猪瘟的重要手段。目前使用的弱毒 疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒 疫苗、日本GPE 疫苗和法国的Thireval 疫苗。我国的猪瘟兔化弱毒 疫苗性能稳定、安全、免疫效果好，且无残留能力，是国际公认的唯一安全有效的弱毒 疫苗，亦是国内唯一应用的弱毒 疫苗。

20世纪70年代后期，猪瘟的流行形式发生了很大变化。地区散发性流行及非典型猪瘟症状的发生，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测时发现有不同的反应模式，猪瘟免疫屡屡失败等，表明猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）的抗原性可能存在着变异，从而使有人对传统弱毒疫苗提出了质疑。随着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖，疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移；加之数十年来CSFV在大规模免疫接种压力下可能出现抗原变异。这些情况都表明，现有的传统疫苗已不能适应新形势的需要，研究和开发新型猪瘟疫苗机是大势所趋。分子生物学技术的兴起和发展，为新型猪瘟 疫苗的研究和开发奠定了基础。1．开发新型猪瘟疫苗的分子生物学基础CSFV是一种小（40-60nm）的有囊膜病毒，含有单股正链RNA基因组。CSFV基因组长约12.5kb，由一个大的开放性阅读框架（open reading frame，ORF）和两侧的5’-端非翻译区（5’-UTR）和3’-端非翻译区（3’-UTR）构成。编码蛋白顺序为Npro、C、Erns （E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3（P80）。除C、Erns 、E1和E2为结构蛋白外，其余均为非结构蛋白。在结构蛋白中，最具有免疫防制研究价值的是Erns 和E2。

Erns 由227个氨基酸残基构成，分子量约为44-48ku，可诱导产生中和谱很窄的中和抗体。Erns 没有疏水的膜锚定结构，为可分泌蛋白。它在由细胞以出芽或胞吐方式分泌的病毒颗粒囊膜上并不稳定，在细胞培养CSFV的上清液中含有少量的病毒粒子，但却含有大量被分泌出的Erns 。Erns 不仅是一种结构蛋白，而且也是一种功能性蛋白，它与CSFV对宿主细胞的嗜性以及致病力有密切关系。Erns 有RNase活性，可降解病毒和细胞的RNA。Erns 可导致免疫抑制，引起动物的淋巴和上皮细胞刁亡。CSFV的宿主嗜性也与Erns有关，用Erns中和单抗可有效阻断CSFV对易感动物细胞的感染。Erns还表现出神经细胞毒性和抗凝集活性，CSFV感染动物后所产生的Erns蛋白在致病过程中起重要作用。

E2的分子量约为53-55ku。E2参与病毒对细胞的感染过程，携带有能刺激机体产生保护性免疫的抗原决定簇，起编码的gp55蛋白是猪瘟的主要保护性抗原。靠近C端的疏水区为gp55的膜锚定结构（TMR），从856位半胱氨酸（Cys）后的第6个氨基酸至C端TMR之间形成有弹性的α螺旋结构，没有抗原决定簇。从N端693位至856位Cys之间形成富含抗原决定簇的2个抗原结构域，这2个结构域由位于737和792位Cys之间的一段片β片层结构隔开。693和737位Cys形成二硫键并组成一个序列非保守性抗原结构域，具有中和性的B、C抗原区位于该结构域中，另一个结构域属序列保守性，由792和856位Cys形成的二硫键组成，包含中和抗原区A和非中和抗原区D，而A和D区由其间的一个疏水区和818位、828位Cys形成的二硫键分开。在A、B、C3个中和区中，各有一段与中和性密切相关的高频突变序列或位点。这些序列或位点的突变株将逃脱中和性单抗的中和作用，免疫血清对对这类突变株的中和作用也会降低。

全长感染性cDNA克隆技术使笔者得到了纯粹的CSFV基因组。这一成果为进一步研究CSFV的复制机理、毒力及其决定因素、致弱机理、致病机理、基因产物的功能、特异性诊断、宿主嗜性以及DNA疫苗和标记疫苗的开发等，打下了坚实的基础。目前为止，已经成功构建了CSFV C-株、Brescia-株和Alfort/187-株等全长感染性cDNA。2．新型猪瘟疫苗的研究和应用前景2.1 CSFV基因缺失型弱毒疫苗通过非天然宿主传代选择得到的突变株，其基因组可发生多个突变。当某些一病毒复制无关的毒力或相关基因缺失突变后，其毒力丧失或明显减弱，但病毒复制能力并不丧失，同时保持着良好的免疫原性。因此，通过基因工程技术致使病毒基因组中负责毒力的基因缺失，可以获得基因缺失型弱毒疫苗株。

由于许多从RNA病毒获得的cDNA具有感染性，所以人们预测RNA病毒缺失株的研究也将逐步开展。由于缺失型弱毒苗是人为地将病毒的毒力基因切除，往往不可能完全自行修复，因而不会发生返祖现象，在遗传特性上比较稳定，是今后弱毒疫苗的研究方向之一。采用缺失的方法可能会制造出免疫原性好，且在安全性上更有保证的弱毒疫苗株，也可以改造现行的免疫原性还不能令人满意的弱毒株以增强其安全性。2.2 CSFV亚单位疫苗 应用化学的方法从病毒粒子中分离出保护性抗原可以制成亚单疫苗。亚单位疫苗是病毒粒子的一部分，不含有核酸，非常安全。亚单位疫苗的免疫原性通常较低，需要与佐剂合用，或偶联到适当的载体上应用。从完整病毒粒子上制备具有免疫原性的亚单位疫苗时，由于抗原量的限制，制备过程复杂，成本往往比较高。因此，采用基因工程的方法，不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因，而且能够在体外对其进行改造或修饰，并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中，使病毒蛋白获得大量表达。利用真核细胞高效表达系统来表达CSFV免疫原蛋白，并以此表达产物为抗原可获得基因工程亚单位疫苗。

Hulist等将猪瘟病毒E2基因cDNA重组入核型多角体病毒（AcNPV），并在sf21细胞中表达。用20-100ug的表达蛋白免疫猪，可抵抗100LD50的猪瘟强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。目前，该蛋白的表达水平已被提高至60ug/mL，并且该疫苗于1998面被列入欧洲药典。许多研究者对E2基因亚单位疫苗进行了效力试验，证明其对猪有良好的保护作用，但是不能有效防止猪瘟病毒的传播。

杆状病毒（Baculovirus）系昆虫病毒，能够在宿主细胞内产生大量的蛋白晶状体――多角体蛋白。这些蛋白覆盖并保护着核体内的病毒粒子。该蛋白的表达受多角蛋白启动子调控。通过痘苗病毒等在细胞内表达的外源性病毒蛋白，经提纯后对动物也具有一定的免疫源性。杆状病毒-昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白，昆虫细胞对蛋白质的加工和运转过程与哺乳动物类似，所表达的蛋白“仿真”程度较高，已成为众多亚单位疫苗研究的工具。亚单位疫苗具有安全、稳定、可规模化生产等优点，同时又可根据流行毒株的变化更换合适的CSFV E2 基因，因而具有广阔的应用前景。2.3 CSFV活载体重组疫苗 某些病毒基因组的某一核苷酸序列，将其切除、突变或在该区域内插入外源性基因片段后，均不影响病毒的复制，是病毒的复制非必需区。利用基因工程的方法可以将该复制非必需区克隆出来，体外改造后再将导源性病毒的保护性抗原基因及启动子调控序列等插入其中，通过体内同源重组技术获得重组病毒，利用该重组病毒接种动物，不仅可以诱导机体产生针对异源性病毒的特异性免疫反应，而且在采用宿主特异性载体病毒时，能够使宿主获得针对载体病毒株的免疫力。如果在载体病毒中同时插入多个异源性病毒的保护性抗原基因还可以达到一针防多病的目的。

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）基因组为一线性DNA分子，约150kb，外源基因可稳定地插入其DNA。将与PRV毒性相关的糖蛋白I（gI）和胸苷激酶（TK）基因灭活，使PRV弱毒化，从而成为发展亚单位重组疫苗的一个较理想载体。将CSFV E2基因克隆到该病毒活载体上，即可获得对伪狂犬病和猪瘟的双重保护。Moormann等于1996年拼接出C-株感染性全长cDNA，用强毒E2基因取代原有E2基因，构建出了猪瘟杂交病毒。这一技术改变了传统意义上的弱毒疫苗研究程式，并且在研究猪瘟病毒的基因功能和感染、复制、免疫机理方面具有重大意义。

目前用于表达外源性病毒蛋白的载体包括PRV、痘病毒、腺病毒、疱疹病毒和小RNA病毒等。以无致病力或低毒力的活病毒为载体，将猪瘟病毒E2基因与之重组研制出的基因重组疫苗免疫动物后，可对2种病毒产生良好的保护力。但是，目前对此类疫苗的安全性和实用价值还有争议，因为人类至今还不了解病毒的自然发生及变异机理，也就无法控制这“人造”病毒的未来走向，一旦将该病毒放入自然界中，重组疫苗载体株与其他弱毒性突变株，有可能改变其生物学特征，衍变出对人、兽有害的病毒变种。另外，利用较为普遍的病毒作为活载体所获得的CSFV活载体重组疫苗对于活载体相应病毒感染或已免疫的动物不能产生保护力。2.4 SCFV DNA 疫苗 DNA疫苗是指注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的病毒保护性抗原基因组表达质粒。以配有原核复制元件和真核表达调控元件的质粒载体，将免疫原基因插入该质粒中，用裸DNA接种动物可产生免疫保护。在保证该重组子在注射动物后不会发生散播，即不具有传染性的同时，该重组子在动物体内对细胞的传染率及在细胞内的表达水平将影响该疫苗的免疫效力。

DNA疫苗是近年发现并形成的一种新疫苗，已有许多用该技术将一些具有药用价值的活性蛋白基因与载体重组，注射动物后成功产生活性蛋白的例子。Yu等Hammond等和Andrew等分别构建了CSFV E2基因的重组表达质粒，并且证明它对猪有较好的保护作用。

重组DNA可通过发酵培养方式大量制备，又具有相对较好的稳定性，并且大容量的质粒还可同时容纳多种病毒的免疫原基因。DNA疫苗免疫的最大优点是可以在同一时间，通过质粒携带的编码不同病毒抗原的基因进行免疫。若同时将编码细胞因子的基因插在质粒上，不但可以提高免疫反应，而且可以使反应从Th1向Th2型过渡。这样通过使用合适的启动子、细胞因子和适当的载体，不但可以产生终身免疫，同时还可以调控免疫反应的类型。另外，DNA疫苗还可有效排除母源抗体的干扰。核酸疫苗虽起步较晚，但具有很大的开发潜力和应用前景。如果核酸疫苗潜在的安全性和接种方法能够得到解决和改进，那么，CSFV核酸疫苗会为猪瘟疫苗研究领域注入新的活力。2.5 SCFV全长感染性cDNA标记疫苗 标记疫苗是在分子水平上，将具有选择性标记的基因克隆到致弱病毒全长cDNA中，经过检测，可以区分抗体来自于自然感染还是标记疫苗免疫，从而鉴别出感染猪群和免疫猪群。标记疫苗的开发有可能成为猪瘟疫苗发展的一个主要方向。

1998年Moser等将编码细胞氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyl transferase，CAT）基因插入到Alfort/187株全长cDNA克隆pA187-1的Npro二者的酶活性。插入病毒的CAT基因在病毒传过10代后依然保持稳定。2000年de Smit等利用中国C-株的基因组DNA拷贝构建了2个重组CSFV（Flc2，Flc3）。试验表明，重组病毒在兔和猪中保留了父代C-株的生物学特性和免疫原性。C-株全长cDNA可作为基质以开发活的重组CSFV标记疫苗。

CSFV全长感染性cDNA标记疫苗，可有效地区别自然感染猪群与免疫猪群，是建立快速、准确的CSFV诊断试剂盒的基础；同时，CSFV C-株全长感染性cDNA标记疫苗的研制和开发，有望为我国C-株弱毒疫苗在西欧等国的推广铺平道路。随着研究的不断深入，不远的将来新型猪瘟疫苗将会陆续诞生，随之它对养猪业健康稳定的发展必将发挥重要保护作用。

引自：《中国兽医科技》2003年第3期 第33卷胡建和1，2，陈永耀2，王自良2，谢庆阁1（1.中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046；2.河南职业技术师范学院 动物科学系，河南 新乡 453003）

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