猪液态精液人工授精技术在现代养猪业中已广泛应用，猪冷冻精液人工授精因不能保证受胎率和产仔数，目前还没有得到商业化使用。猪精液冷冻保存同液态保存相比，在精液的运输、保存时间和便利性等方面均有着巨大的优势。目前，猪精液冷冻保存研究取得了一定的成果，Polge在世界上首次使用猪冷冻精液人工授精并受孕产仔，随后世界许多科学家在精液冷冻液配方的筛选、提高解冻后精子的活率和顶体完整率等方面进行了较多研究。2000年以后中国才对猪冷冻精液人工授精技术开始关注，谢成侠、周佳勃等和李青旺等采用颗粒冷冻法和细管冷冻法对猪精液进行了冷冻保存研究，虽然在冷冻保存液筛选取得了一定的进展，但因颗粒和细管冷冻精液输精后受胎率低、窝产仔数少而未能应用到生产中。为保证猪精液冷冻后的精液品质，同时不影响受胎率和窝产仔数，本实验通过大剂量袋装法对猪精液冷冻保存效果进行了研究。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 公猪来自河南省新郑市孟庄种猪配种中心，2～4岁大约克夏、长白和杜洛克品种公猪各4头;母猪来自河南省种猪检测中心和河南省定远猪场的大约克夏、长白和杜洛克繁殖母猪。

1.1.2实验仪器 主要仪器有电子天平、生物显微镜、大容量离心机、恒温水浴箱、冰箱、冷冻槽、酸度计、容量瓶、移液枪、全套猪人工授精设备等。

1.1.3实验药品 猪BTB精液稀释粉，猪袋装冷冻保存液(郑州牧业工程高等专科学校动物繁殖实验室配制)，液氮等。

1.2实验方法

1.2.1采精 用手握法采精，收集中段乳白色部分，经精液品质检查活率0.7以上、密度大于1X109个/ml的精液待用。

1.2.2精液处理 用BTS常温保存液按l：2将精液稀释后，同一品种公猪精液混合，以大容量离心机800r/min离心12min，将精液浓缩为2×109个/mL以上。用猪袋装冷冻保存基础液将浓缩后的精液进行l：1稀释后，经30min降温至l～4℃，再用猪袋装冷冻保存液按1：l稀释在l～4℃平衡1.5h。

1.2.3分装和冷冻 经过平衡的精液进行精液品质检查，要求活率大于0.6、顶体完整率50%以上、密度5×108个/mL以上。再用5mL容量的抗低温塑料袋按5mL/份分装，端口用热封口机密封(要求分装好的塑料袋厚度不能大于0.2cm，每袋总精子数2.5X109个/mL以上)。在自制的简易液氮冷冻槽中，距离液氮面2ClTI处用铜纱网作为冷冻面，分装好的精液直接放置在铜纱网上，盖上冷冻槽盖子，用液氮熏蒸5min，然后投入到液氮中进行冷冻。

1.2.4解冻 将猪袋装冷冻精液从液氮中取出，用剪刀剪开两端后投入到40℃盛有BTS常温保存液的50mL猪一次性输精瓶中，在40℃水浴下摇动至完全溶解。

1.2.5解冻后抽样检查 分批次(I、Ⅱ、Ⅲ)对冷冻后的精液进行抽样检查。用估测法在显微镜400倍下估测活率;用巴氏染液法和伊红染液法分别对精液进行染色，显微镜400倍下计数100个以上精子，并计数顶体完整的精子和着色的精子，算出顶体完整率和死活精子比例;有效存活时间是精液解冻后精子活率≥0.4所需的时间，实验在37℃水浴条件下，每隔10rain检查活率1次，直到活率小于0.4为止。

1.2.6输精 实验组采用袋装冷冻精液人工授精，对照组采用BTS保存液稀释后18~e保存，每份60mL，总精子数大于3X109个。母猪压背出现静立反应确定为发情，在发情后6～12h第1次输精，间隔12h第2次输精。输精后30d经B超检测，确定妊娠与否，妊娠母猪在分娩后分别统计产仔数和活仔数。

1.3统计分析 采用SPSS Statistics17.0对不同品种猪袋装冷冻精液解冻后的精液品质指标进行LSD多重比较，对猪袋装冷冻精液和鲜精人工授精效果进行t检验。

2结果

2.1猪袋装冷冻精液解冻后的效果 从表1可以看出，对大约克夏、长白、杜洛克3个品种公猪精液采用袋装冷冻，解冻后，活率均在0.4以上、死活精子比例为59%～74%、顶体完整率58.7%～71.6%、有效存活时间为50～80min。

从表2的LSD多重比较结果可以看出，大约克夏、长白、杜洛克3个品种公猪袋装冷冻精液解冻后活率、死活精子比例、顶体完整率和有效存活时间均无显著性差异( P>0.0 5 ) 。

2.2猪袋装冷冻精液人工授精效果 从表3可以看出，经2次输精后，情期妊娠率为90.2%、窝产仔数10.6头、活仔率95.7%，经t检验与对照组显著性差值分别为妊娠率0.554、窝产仔数0.232、活仔率0.604，说明实验组和对照组无显著性差异(P>0.05)。

3讨论

冷冻保存液筛选和冷冻方法是猪冷冻精液制作的关键环节。猪冷冻精液保存液的筛选，尤其是抗冻剂的筛选是精液冷冻的前提，保证冷冻后精液的活率和精子的顶体完整率，才能保证有效精子数。从抗冻剂的选择来看，甘油和乙二醇2种抗冻剂配合使用较多，也能显著提高冻后精子的活率与存活时间，常用的为甘油3%、乙二醇0.5%；在冷冻保存液中添加咖啡因也能显著的提高解冻后精子的活率和顶体完整率。

对于猪精液的冷冻方法，多数研究者未能与猪自身的繁殖生理相结合，过于模仿牛冷冻精液的制作方法。猪是多胎动物，平均排卵数在14～l6枚，猪子宫角长而且皱褶多，运行时遇到的障碍也多，精子从输精部位到受精部位运行时间、距离也长;而牛是单胎动物，子宫角也较猪的短，且平整些，精子运行的难度相应小。猪人工授精如采用颗粒或细管冷冻精液，由于输精剂量少(颗粒0.1mL，细管为0.2mL和0.5mL 2种)，有效精子也不可能超过10个/mL。猪人工授精要保证受胎率不受影响，一次输入的有效精子数不能低于l08个/mL，因此，颗粒和细管冷冻精液根本无法满足猪人工授精的需要。

猪精液袋装冷冻方法，对猪精液浓缩后，采用5mL抗低温塑料袋冷冻。每头份有效精子数均在l08个/mL以上，保证了有效精子数，解冻时采用解冻液稀释，保证了输精剂量在50mL以上。从本实验结果来看，猪袋装冷冻精液与液态保存精液的人工授精，在妊娠率、窝产仔数和活仔率上均无显著性差异。

4结论

猪袋装冷冻精液人工授精后母猪的妊娠率为90.2%、窝产仔数为10.6头、活仔率为95.7%，可以用于猪精液的保存和人工授精。

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