猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）为冠状病毒科的成员，与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染引起的临床症状和病理变化极为相似，该病原可致各种年龄的猪发病，其特征症状为呕吐、腹泻和脱水，本病呈地方流行性，仔猪有较高的发病率和死亡率，给某些养猪场带来严重经济损失^[1]。

对曾发生过该病的猪场或接种过PEDV弱毒疫苗的妊娠母猪，仔猪主要通过初乳获得对PEDV的抵抗力，母源抗体消失后的断奶仔猪常出现顽固性腹泻，而一旦暴发猪流行性腹泻，目前尚没有特别有效的防治措施。鉴于卵黄抗体与初乳作用机理相似，都是通过被动免疫途径达到对仔猪的保护，因而研制抗PEDV卵黄抗体^[2]，应用于发生PED的猪场，对防止PED的流行及降低该病造成的损失将具有重要意义。

本试验利用一株猪流行性腹泻病毒分离株，制备免疫原免疫产蛋鸡，收集高效价卵黄，分离提纯卵黄抗体，用于PED的治疗和预防，从而为防治PED研制一种疗效显著、使用方便、易于大量获得且无环境污染的生物制剂。

 

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 病毒和细胞   猪流行性腹泻病毒分离株来自中国农业大学兽医学院；增殖病毒用Vero细胞，由本室保存。

1.1.2 试验试剂    培养细胞用培养基和血清购自GIBCO BRL公司；弗氏佐剂购自中国兽药监察所。

1.1.3 试验动物    120日龄待开产非免疫蛋鸡,购自中国兽药监察所；1日龄未吃初乳仔猪购自京郊某猪场。

1.2方法

1.2.1P EDV在猪体内增殖   1日龄未吃初乳仔猪人工哺乳，PEDV口服攻毒，出现腹泻24小时后剖杀，取小肠组织用于提取和纯化PEDV。

1.2.2P EDV提取与纯化   刮取小肠内壁组织及内容物充分研磨，加10倍体积PBS稀释，反复冻融3次后离心，取上清液用PEG6000进行纯化并浓缩，经0.22μm微孔滤膜过滤后即为提纯PEDV^[3]。

1.2.3 P EDV在细胞上增殖   培养Vero细胞，细胞单层长至75%以上时，接种提纯PEDV并加入50μg/mL胰酶以助病毒吸附，若72小时后细胞病变(CPE)不明显，则收获细胞盲传下1代，盲传至第5代出现CPE，此时收获病变细胞，反复冻融3次后离心取上清液，最后对病毒上清液进行浓缩备用^[2，4，5]。

1.2.4 免疫   浓�病毒液经0.5%甲醛灭活后与等量弗氏佐剂乳化作为免疫原。首免前5日用破伤风类毒素等混合制剂对每只鸡胸肌多点注射0.5mL，以刺激机体免疫反应。首免免疫剂量1mL，胸肌多点注射；分别间隔两周进行二免和三免，免疫剂量增至1.5mL和2mL。

1.2.5 抗体效价检测    二免后1周开始，每周采血和收集卵黄，应用琼脂扩散试验检测血清抗体和卵黄抗体效价，比较二者的变化动态，至卵黄抗体效价达到1∶64时收集卵黄。

1.2.6 卵黄抗体提纯    无菌收集高效价卵黄，先后加入2倍体积生理盐水和1/2体积氯仿充分振荡，离心后收集上清液，先后用50%和36%硫酸胺沉淀卵黄抗体，最后溶于与原卵黄量等体积的生理盐水中， 4 ℃ 透析24小时，即为提纯卵黄抗体。

1.2.7 提纯卵黄抗体检测    应用BCA Protein Assay Kit（购自Pierce公司）测定卵黄抗体的蛋白浓度；卵黄抗体纯度通过SDS-PAGE蛋白质电泳检测；而卵黄抗体的效价用琼脂扩散试验检测。

1.2.8 卵黄抗体抗病毒活性测定   刚出生未吃初乳仔猪18头，采用人工哺乳，随机分成两组，治疗组12头，对照组6头，适应24小时后攻毒，仔猪开始出现腹泻时治疗组口服提纯卵黄抗体液，每猪每次2ml，每日3次；对照组口服等量生理盐水。逐日观察，以粪便指数和死亡率两个指标反映治疗组和对照组差异是否显著。粪便指数按照Sherman等^[6]制定的标准判定，即0分为正常，粪便固态成形；1分为轻度腹泻，粪便稀软成形；2分为中度腹泻，粪便呈黄色水样；3分为重度腹泻，粪便呈水样喷射。

 

2结果

2.1血清抗体和卵黄抗体效价检测    结果显示，二免后1周血清抗体较卵黄抗体效价高，血清抗体效价上升快，至三免后2周达到峰值，之后其效价快速下降；而卵黄抗体效价上升较慢，三免后3周达到峰值，之后其效价缓慢下降，较血清抗体维持2.2卵黄抗体浓度、纯度和效价测定    卵黄经氯仿去脂后蛋白浓度为14.5mg/mL ,经硫酸胺沉淀并透析后蛋白浓度为10.2mg/mL;SDS-PAGE蛋白质电泳(图2)显示不同方法处理后卵黄抗体纯度明显提高，卵黄抗体由分子量约为66kd和35kd的重链和轻链组成，与文献报道一致^[7]；氯仿去脂后琼扩效价为1∶8，而透析后上升至1∶64。

                           

35kd

66kd

67kd

2.3卵黄抗体抗病毒活性测定    攻毒后12－24小时所有仔猪均出现不同程度的黄色水泻，治疗组在口服卵黄抗体液后腹泻症状逐渐减轻，4-5天后基本恢复正常，死亡率仅16.7%；而对照组腹泻呈水样喷射，死亡主要出现在攻毒后2-3天，死亡率为100%，两者差异极显著。结果见表1。

 

表1   仔猪攻毒治疗后不同天数死亡情况及粪便指数结果

Tab.1  Comparison of mortality rate and fecal scoring between the IgY treatment group and the control group

 

	1d	2d	3d	4d	5d	死亡率 Mortality rate
治疗组 IgY treatment group	12/12(2.3)	10/10(2.0)	6/10(0.6)	2/10(0.2)	0/10(0)	16.7%
对照组 control group	6/6(3.0)	4/4(3.0)	1/1(3.0)	0	0	100%

注：分母为存活仔猪数，分子为腹泻仔猪数；括号内为存活仔猪平均粪便指数。

Note: the numerator/denominator means No. of diarrhea piglets/No. of survival piglets; Numbers within parentheses indicate the mean fecal scoring.

 

3讨论

    猪流行性腹泻病毒感染呈地方流行性，传播较慢但感染后在养猪场持续存在，仔猪母源抗体消失后即发病，死亡率较高，同时排毒和散毒感染陆续出生的仔猪，抗生素治疗无效。本实验研制的卵黄抗体经口服后在肠道内与PEDV作用，可阻止病毒的吸附和感染，同时病毒排出体外后失去感染力，对该病流行也有一定的抑制作用。目前国内尚未见针对PEDV卵黄抗体研制的报道。

本试验采用氯仿去脂和硫酸胺沉淀来提纯卵黄抗体，卵黄经氯仿处理后易于去除脂类和不溶性蛋白，上清液澄清透明，再利用盐沉淀可进一步提纯和浓缩抗体，操作简单方便，抗体纯度高，缺点是处理样品量少，氯仿造成环境污染。

血清抗体和卵黄抗体效价比较结果显示，免疫后血清抗体效价先上升，到达峰值后下降也较快；卵黄抗体效价上升稍慢，但达到峰值后常维持较长时间，下降也较慢；但血清抗体和卵黄抗体效价总的变化趋势是一致的。

卵黄抗体的分子量约为180kd，由两条重链和两条轻链组成，本实验蛋白质电泳结果显示两条蛋白条带分别为66kd的重链和35kd的轻链，说明我们已提纯制备了卵黄抗体。

通过仔猪攻毒和卵黄抗体治疗试验显示，口服卵黄抗体的仔猪得到了有效保护，说明卵黄抗体具有明显的抗病毒活性，可以应用于PEDV感染仔猪的治疗。

猪场一旦发生PED，目前尚没有特别有效的防治措施，因而该病应以预防为主，在加强养猪场综合预防措施的同时，在有猪流行性腹泻发病史的猪场，给妊娠母猪注射弱毒疫苗，新生仔猪添加卵黄抗体，对防治该病将具有重要意义。

相关文章